La plupart des méthodes produisent des arbres non enracinés car elles détectent des différences entre séquences mais n'ont aucun moyen d'orienter temporellement ces différences. Les arbres non-enracinés ne permettent pas de déduire des relations de descendance, alors que dans le cas des arbres enracinés, la direction représente le temps dévolution, plus un noeud est proche de la racine, plus il est vieux.

Il existe deux façons d'enraciner un arbre:

1.  La méthode du groupe externe: en incluant un groupe de séquences connues a priori comme externes au groupe d'intérêt. La racine est alors sur la branche qui relie le groupe externe aux autres séquences.

2.  La méthode de l'hypothèse de l'horloge moléculaire: en supposant que toutes les lignées ont évolué à la même vitesse depuis leur divergence. La racine est le point de l'arbre équidistant de toutes les feuilles.

Figure 5: Arbre enraciné (Pierre-Henri Gouyon)

Figure 6: Arbre non-enraciné (Pierre-Henri Gouyon)